本试剂盒用于定量检测血清、血浆、细胞培养上清液等样本中人催产素（OT）的浓度，规格分为 48T 和 96T。在使用前，请仔细阅读本说明书。

一、产品关键参数

1. 检测范围：6.25 - 200 pg/mL。
2. 特异性：与结构类似物无交叉。
3. 灵敏度：小于 1.0 pg/mL。
4. 重复性：板内变异系数均小于 10%，板间变异系数均小于 15%。
5. 保存与有效期：2 - 8℃保存，有效期 6 个月。

二、实验原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人催产素（OT）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，依次加入人催产素（OT）校准品和待测样本，随后加入 HRP 标记的抗人催产素（OT）抗体（酶标抗体）。经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体 - 抗原 - 酶标抗体的夹心复合物。接着加入底物 A 和 B，底物在 HRP 催化下产生蓝色产物，再在终止液（2M 硫酸）作用下最终转化为黄色。通过酶标仪在 450nm 波长上测定吸光度（OD 值），该值与待测样品中人催产素（OT）的浓度呈正相关。通过拟合校准品曲线，即可计算出样本中人催产素（OT）的浓度。

三、试剂盒限制性

1. 本试剂盒仅用于科研，严禁用于临床诊断。
2. 请在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品切勿使用。
3. 请勿与其他厂家的试剂盒或组分混用。
4. 请使用试剂盒配套的样品稀释液。
5. 若样本值高于最高标准品浓度值，需将样本适当稀释后重新测定。
6. 待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体可能干扰检测结果，检测前需排除该因素。
7. 通过其他方法获得的检测结果与本试剂盒测定结果不具有直接可比性。

四、技术提示

1. 混合蛋白溶液时，注意避免产生气泡。
2. 加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应悬臂加样，防止交叉污染。
3. 确保合适的温育时间和充分的洗涤步骤，这是保证实验结果准确性的关键。
4. 使用自动洗板机时，加入 30 秒浸泡步骤，可提高检测精度。
5. 底物溶液应为无色液体，若保存过程中变为蓝色，表明底物溶液已失效，不可使用。
6. 终止液加样顺序与底物溶液一致，加入终止液后，蓝色底物产物会迅速变为黄色。
7. 实验中用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
8. 所有液体组分使用前需充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

五、未提供仪器用品

实验过程中需准备以下用品：酶标仪（450nm）、精密移液器及一次性吸头、蒸馏水、洗瓶或者自动洗板机、37℃水浴锅或恒温箱、500ml 量筒。

六、试剂盒组分与保存

未开封的试剂盒需保存在 2 - 8℃，不得使用过期试剂盒。各组分信息及开封后储存条件如下：

1. 校准品：0.3ml / 管，开封后 2 - 8℃可保存 14 天。校准品浓度依次为 200、100、50、25、12.5、6.25 pg/mL。
2. 包被微孔板：96T/48T，预包被固相抗体，开封后 2 - 8℃保存 14 天。
3. HRP 标记抗体：10mL，为 HRP 标记的检测抗体，开封后 2 - 8℃可保存 180 天。
4. 样本稀释液：6mL，开封后 2 - 8℃保存 180 天。
5. 底物液 A：6mL，含 0.01% 过氧化氢，开封后 2 - 8℃保存 180 天。
6. 底物液 B：6mL，含 0.1% TMB，开封后 2 - 8℃保存 180 天。
7. 终止液：6mL，2mol/L 稀硫酸，开封后 2 - 8℃保存 180 天。
8. 20× 浓缩洗涤液：25mL，含 0.05% Tween20，开封后 2 - 8℃保存 180 天。
9. 说明书：1 份。
10. 自封袋：1 个。
11. 不干胶：2 片。

七、生物安全

1. 检测必须遵循实验室管理规范，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和废弃物都应按传染物处置。
2. 试剂盒的液体组分中含有 proclin - 300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，应避免吸入烟雾，避免与皮肤接触。
3. 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。
4. 实验时应戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。

八、样品的采集和储存

样本采集

1. 细胞培养上清：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
2. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免细胞刺激，4000rpm 条件下离心 20min，小心分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
3. 血浆：以肝素、EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下离心 20 分钟取上清，血浆保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。
4. 组织匀浆：用预冷的 PBS (0.01M, pH = 7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS（一般按 1 : 9 的重量体积比，具体体积可根据实验需要调整并记录，推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为进一步裂解组织细胞，可对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000×g 离心 5 - 10 分钟，取上清检测。
5. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g 离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次。每 1×10⁶ 个细胞中加入 150 - 200μL PBS 重悬并通过反复冻融使细胞破碎（若含量很低可减少 PBS 的体积）。将提取液于 1500×g 离心 10 分钟，取上清检测。
6. 其他生物体液：1000×g 离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片，取上清检测。

样本储存

样本收集后若无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融。使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

九、试剂准备

1. 使用前，样本和试剂盒所有的组分都要至少复温 120min，确保充分复温到室温。
2. 浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液可能会有结晶产生，这属于正常现象，可水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水按 1 : 20 稀释，即 1 份的浓缩洗涤液添加 19 份的蒸馏水。
3. 底物：底物液 A 和 B 在使用前，按 1 : 1 体积充分混合，混合后 15 分钟内使用。

十、操作程序

所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品建议做复孔。

1. 按说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2. 从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3. 设置标准品孔、0 值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL，0 值孔加样本稀释液 50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本 50μL。
4. 除空白孔外，标准品孔、0 值孔和样本孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL。
5. 用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 60min。
6. 揭开封板膜，弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 20S，甩去洗涤液，再在吸水纸上拍干，如此重复 5 次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡 30s 的程序，可提高检测精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上充分拍干反应板。
7. 将底物 A 和 B 按 1 : 1 体积充分混合，所有孔中加入底物混合液 100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱避光孵育 15min。
8. 所有孔加入终止液 50μL，在酶标仪 450nm 波长上读取各孔吸光度（OD 值）。

十一、结果计算

1. 以标准品浓度做为横坐标（6 个标准品孔加 1 个 0 值孔，共 7 个浓度点），对应的吸光度（OD 值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。
2. 如果样品被稀释，通过上述方法测得的浓度值要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

十二、试剂盒性能指标

1. 物理性能：试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2. 剂量反应曲线线性：校准品剂量反应曲线相关系数 r 值大于等于 0.9900。
3. 精密度：批内精密度为三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估；批间精密度为三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批内变异系数和批间变异系数均需符合一定标准。
4. 灵敏度：最低检出剂量小于 1.0 pg/mL（6 次独立实验的平均值）。通过 10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD 计算最低可检测浓度。
5. 回收率：分别往不同样本中添加已知的高、中、低浓度目的蛋白样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在 85% - 115% 之间。不同样本类型的回收率有所差异。
6. 特异性：本试剂盒识别天然和重组人活化转录因子 3（ATF3），与结构类似物无交叉。
7. 稀释线性：将添加有高浓度人催产素（OT）的样本分别稀释 2 倍、4 倍、8 倍、16 倍做回收实验，得出不同稀释倍数下各样本类型的回收率范围及平均回收率。

十三、重要说明与警告

1. 由于现有条件及科学技术水平限制，本产品可能存在一定质量技术风险。
2. 最终实验结果与试剂有效性、实验者操作及实验环境密切相关，请准备充足标本备份。
3. 不同批次同一产品可能有少许差别，网站电子版说明书仅供参考。
4. 本试剂盒配套试剂必须配套使用，不能混用其他制造商产品。严格遵守实验说明才能得到最佳检测结果。
5. 用于制备试剂盒中抗体的免疫原通常为重组蛋白，但无法保证该试剂盒可用于其他公司重组蛋白的检测，通常不建议使用试剂盒检测重组蛋白。
6. 本试剂盒仅供研究使用，如用于临床诊断或其他用途，公司将不承担任何责任。

本试剂盒中使用的稀硫酸作为终止液具有轻微腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。若在实验过程中遇到问题，可参考问题解答部分寻找可能原因及解决方案。