01

流式染色完来不及上机该如何保存样本呢?

短时间过夜保存的话可以将样本重悬在染色缓冲液Cell Staining buffer（Biolegend货号420201）中，4度避光保存；对于24-48h的保存，建议先将样本进行固定处理20min，再洗涤将细胞重悬于Cell Saining buffer中；对于更长时间保存含胞内因子染色的样本，可以将细胞存放在Biolegend专用的流式样本保存液Cyto-Last Buffer，可以保存长达2周。关于流式固定的常见问题可以参考链接：https://mp.weixin.qq.com/s/wf5db7SfhhvGR7sGymTIVQ

02

使用BioLegend抗体可以进行细胞分选吗？

一般来说Biolegend的抗体可用于细胞分选。但请注意，流式抗体未经内毒素测试并含有0.09%的叠氮化物，但含量较低不会影响细胞的活力。另外，抗体在4°C或冰上与细胞一起孵育可以有效防止细胞发生活化。

03

只要是荧光抗体就可以用于共聚焦显微镜吗?

一般情况下都是可以的。但有时候强度不够，需要选择荧光强度大的染料。

04

为什么CD68和CD206作为CD分子也需要固定破膜？

绝大多数CD分子确实是表达在细胞膜外层的，但小鼠CD206（对应抗体克隆号C068C2）和CD68(对应抗体克隆号FA-11与Y1/82A)的抗体识别表位位于细胞膜的跨膜区，因此需要固定破膜的胞内染色才能获得更好的阳性信号。

05

若短时间无法对我的血液样本进行流式分析，那么应该如何保存？

血液样本新鲜提取后建议室温保存并在8-12h内进行检测，这是由于血液样本中的粒细胞群半衰期较短；而室温保存下24h内进行流式检测对免疫表型结果影响不大。另外对于抗凝剂的选择，大多数人外周血样本在室温条件下保存于肝素钠抗凝管中比EDTA更稳定。关于血样样本保存的具体方案可以参考链接：https://mp.weixin.qq.com/s/o13zPXlLhF57jUP3Wfqw2g

06

流式中检测细胞表面和细胞内蛋白表达水平的抗体有何区别?

抗体只是针对相应抗原的，至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响，你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的，应该是可以用同一种抗体进行检测的，在流式操作时只需注意:如果是针对胞内，则需要加破膜剂，让抗体能和相应抗原接触，否则就不需要了

07

如何正确使用花青素耦合的荧光抗体对单核细胞群体进行表型分析呢？

像PE/CY7、PE/CY5、PerCP/CY5.5等花青素染料，由于单核细胞高表达Fc受体并可非特异性结合此类染料，流式染色时建议您使用Biolegend Fc受体阻断剂和单核细胞封闭剂True-Stain Monocyte Blocker （Biolegend货号 426101）以便在进行流式细胞术染色时减少背景。（图示为人的PBMC样本染色同型对照抗体后未使用与使用单核细胞封闭剂的流式结果对比图）

08

如何选择合适的流式破膜固定液？

不同指标对固定破膜剂的要求不同。True-Nuclear转录因子试剂能为细胞核转录因子(比如FOXP3)提供了最佳的染色条件。而Cyto-Fast Fix/Perm Buffer Set，可用于哺乳动物细胞的胞内因子染色的固定和破膜。另外，不同的品牌抗体和固定破膜剂不建议同时使用。

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核内因子（磷酸化蛋白）是否可以与胞内细胞因子同时染色？

不推荐将胞内和核内因子共同染色。如果检测的是核内因子我们会推荐 True-nuclear固定破膜液，核内指标的破膜作用比细胞因子的更加强烈，细胞因子容易向细胞外泄露导致阳性信号丢失。相反，使用胞内染色固定/破膜缓冲液可能达不到打孔细胞核膜的作用，抗体由于未充分进入细胞核而导致染色效果不佳。

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怎样选择流式同型对照?

同型对照(Isotype Control):使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum(与一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified(纯化的) mouse IgG2a来做OX-42的同型对照(Isotype Control)。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值)应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备(如同一品牌)的产品。

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请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照?

首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么，再确定该抗体的来源种属，选择相应的同型对照。如:你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原， 荧光染料为FITC， 抗体来源为大鼠的IgG1亚型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC (IgG1)， 你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC， 一般的抗体说明上都会写清

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如何查找同型对照？

理论上需要选择相同品牌、相同荧光素、相同种属、相同重链和轻链的同型对照抗体，在BioLegend官网上的产品详情页里可以找到推荐的同型对照产品链接（位于下图紫色字体的Isotype Control处）。

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在进行胞内因子染色时, Fc Block试剂有多重要?该如何应用?

 Fc 受体的应用时非常必要的,尤其是用于单核细胞或粒细胞。FcBlock 应在固定破膜之前使用。目前 Biolegend 可提供针对小鼠（货号  101319）针对人（货号 422301）的  Fc Block 产品。而对于人类细胞的胞内染色，Fc受体的阻断并不是特别重要。特定情况下检测人类样本时，可以应用常规的阻断剂如相同物种的不相关纯化 Ig，或染色抗体来源物种的血清。

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背景荧光（非特异性染色）高

背景荧光高（即非特异性染色明显）可能是多种因素造成，例如荧光素、抗体、标记方法、仪器、其它试剂或数据分析等

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为什么流式抗体或ELISA的抗体很难应用于Western Blot实验？

流式或ELISA抗体一般都是识别抗原的3D构象和抗原决定簇的表位，但在WB实验中，靶蛋白由于高温和SDS作用导致变性，其表位已发生改变，因此使用流式或ELISA的抗体无法识别抗原表位。

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