文章信息
文章题目：GWAS揭示酸性磷酸酶ACP2在缺磷条件下通过丝氨酸代谢调节水稻光合作用
影响因子：9.4
组学技术：GWAS＆转录组＆代谢组
技术路线
研究背景
光合作用被认为是地球上最重要的过程，在自然界中，植物的生产力依赖于光合作用。而无机磷缺乏会显著影响植物的生长、发育和光合效率。目前，有一项连锁图谱研究表明pi效率和光合作用相关性状（如净光合速率和蒸腾速率）之间存在显著的遗传关系。然而，Pi效率和光合作用相关性状都是复杂的数量性状，且都是基因型特异性和环境敏感性的，因此对这两个性状的QTL多效性报道很少。也很少有研究者利用GWAS研究水稻光合磷利用效率（PPUE）的调控机制。
PPUE与Pi利用效率之间的相关性
作者通测量了20个水稻品种在磷充足(Pi+)和缺磷（Pi-）条件下的光合效率，确定了磷利用效率与光合速率之间的关系，并以PPUE(Asat Pi-/Asat Pi+)表示光合Pi的利用效率。结果表明，PPUE在这些水稻品种中表现出与生物量相似的模式。PPUE与生物量比值的相关性系数（r2）为0.6，表明PPUE与磷利用效率之间可能存在密切关系。如图1所示。
图1
通过GWAS确定PPUE性状的候选基因ACP2
作者研究了整个水稻MiniCore群体（206个品种）中Asat Pi-、Asat Pi+和PPUE的遗传和表型自然变异。结果表明，这三个参数在整个MiniCore种群中都表现出显著的自然变化（图2A-C）。对PPUE和Asat Pi-进行GWAS分析，结果显示在2号染色体上发现了与这两种性状相关的重叠的SNP峰（图2D和2E）。混合线性模型(MLM)分析证实了PPUE和Asat Pi-观测值和预期值之间存在很强的相关性（图2F和2G）。然而，Asat Pi+的GWAS结果显示，没有显著的SNP峰与这两种性状相关。连锁不平衡(LD)分析结果显示，在以SNP(2m7084278)为中心的50kb基因组区域内，存在两个不同的区块，P=2.3×10-5（图3A）。在这个基因组区域内（block2），作者确定了9个候选基因。随后对20个种质（10个低PPUE和10个高PPUE）中这些基因的相对表达水平进行评估，结果显示，只有ACP2基因表达在Pi+和Pi-条件下都发生了显著改变。在高PPUE的种质中ACP2表达水平最高，表明磷酸盐响应性显著提高。这表明ACP2可能是控制水稻PPUE的候选基因（图3C）。
图2 在水稻 MiniCore 群体中对 PPUE 性状进行的 GWAS 研究
图3 在水稻 MiniCore 群体中筛选 PPUE 性状候选基因
ACP2基因的单倍型分析
在ACP2基因中观察到10个多态性SNP，其中7个位于启动子区内，1个位于第二个外显子内，2个位于终止子区内，表明其对基因表达具有潜在的影响（图4A）。这10个SNP被分为两种不同的单倍型，即HapI和HapII。与HapII（包含75个种质的）相比，HapI（包含131个种质）的Asat Pi-和PPUE均显着降低。这表明这些单倍型在ACP2基因对这些性状中的作用具有潜在的功能影响。比较分析显示，与HapII相比，HapI组的Asat Pi-和PPUE水平显着降低，表明在这些性状受单倍型影响。然而，两组之间Asat Pi+水平没有显着差异（图4B-3D）。单倍型的地理分布显示，大多数HapI种质（34.1%）来自IND，而HapII主要来自AUS种质（48.6%），这表明可能有潜在的区域适应性或选择压力（图4E）。进一步分析将这10个SNP归入单个LD区块，发现它们之间存在很强的遗传连锁。这种紧密的联系表明，这些SNP可能共同影响ACP2基因功能，从而影响相关性状。
图4 水稻 MiniCore 群体中ACP2基因的单倍型分析
ACP基因特性分析
作者证实，仅在Pi+条件下，ACP2在叶片中高表达，在花、根和芽中的表达量大大降低，而ACP2在种子中呈弱表达。此外，HapI型和HapII型分别对应水稻MiniCore群体中的L4108和Q4147水稻品种。在这两个水稻品种中，ACP2的表达都受到Pi-的刺激，与L4108相比，Q4147在Pi-条件下20小时后叶片和根组织中的ACP2表达量更高。ACP2蛋白的序列非常保守，存在于多种C3和C4物种中。对类似同源基因的调查表明，ACP2及其同源基因含有三个保守的motifs，这是典型的卤酸脱卤酶(HAD)结构域特征。
在内质网(ER)和高尔基体(GA)中均观察到ACP2蛋白的定位(图5A)。我们使用各种有机Pi化合物来测试ACP2的底物特异性。还纯化了重组ACP2蛋白以确定其生化特性。生化测定结果表明，ACP2对磷酸乙醇胺(PE)表现出最高的磷酸酶活性。此外，ACP2对其他所有测试的有机Pi化合物都表现出高活性，这表明ACP2有广泛的底物选择性(图5B)。在包含不同CDS区域的两种ACP2单倍型之间未检测到对PE的底物活性的显著变化(图5C)。
图5 水稻中 ACP2 的亚细胞定位和特异活性分析
ACP2对PPUE的促进作用以及ACP2启动子区SNP的等位基因效应
为了确定ACP2的功能，作者基于CRISPR-Cas9构建了五个ACP2过表达水稻品系（包括两个单倍型）和一个ACP2突变体。选用具有相似基因和蛋白质表达水平的两种单倍型的两个OE品系，比较v8 SNP变异时单倍型对PPUE的影响（图6A-6C）。从L4108（HapI）和Q4147（HapII）扩增了两种单倍型的序列，分别命名为ACP2v8A和ACP2v8G。结果表明，ACP2v8A和ACP2v8G中的Asat Pi-和PPUE值均呈相似的增加趋势（图6D），而ACP2v8A和ACP2v8G之间的Asat Pi+没有显著改变。这表明ACP2可以促进PPUE，但是CDS区域中SNP的等位基因变异不能改变其催化特性。因此，ACP2两种单倍型对PPUE的生物学效应很可能是由其启动子区的7个SNP介导的。
为了确定磷酸盐响应，作者从处于Pi+和Pi-条件下的水稻植株中分离出原生质体，并通过荧光素酶活性检测携带SNP变体的ACP2启动子的活性。结果表明，在Pi-条件下，HapII中的荧光素酶活性明显高于HapI，但在Pi+条件下则没有这种变化，这表明高磷酸盐响应主要与HapII有关（图6E）。仅当v5的SNP突变为HapII时，ACP2对磷酸盐可用性变化的响应才显著增加（图6E）。为了进一步证明v5变异对PPUE的影响，将v5 SNP上从携带G等位基因的中华11号（ZH11）逆转为携带A等位基因的CRISPR编辑水稻株系，并将其命名为ACP2v5A。在Pi-条件下，ACP2v5A的表现略好于CP2v5G（图6F）。且ACP2v5A中的ACP2基因表达、PPUE、Asat Pi-、分蘖数和生物量均显着高于ZH11（图6G和6H）。
图6 ACP2 对水稻 PPUE 的促进作用。
ACP2与磷酸反应基因PHR2的协同作用
在田间Pi-和Pi+条件下，作者比较了具有不同ACP2表达水平的ACP2和PHR2转基因株系的表现。结果表明，在Pi-条件下的ACP2v8G-OE株系植物的表现优于acp2或PHR2突变体，phr2（图7A）。在暴露于Pi-不同时间后，叶片Pi含量逐渐降低（图7B）。转录组分析揭示，在ACP2v8G-OE中与光呼吸途径相关的9个基因的表达降低，而在acp2中表达增加（图7C）。通过RT-qPCR分析进一步证实了该结果。另外，ACP2v8G中芽的总P含量、Asat Pi-和PPUE增加，在acp2中减少（图7D）。ACP2的两种产物乙醇胺和丝氨酸在ACP2v8G-OE中积累，而与暴露于Pi-下的ZH11相比，acp2中的这两种产物减少（图7E和7F）。与ZH11相比，ACP2v8G-OE中的苗重和产量都显著增加（图7G）。相反，ACP2v8G中的乙醛酸和乙醇酸减少，而在acp2中有所增加，同时光呼吸速率(PR)也增加，甘氨酸除外（图7G-7K）。有趣的是，在Pi-条件下，PPUE、乙醇胺、丝氨酸、芽生物量、甘氨酸、乙醛酸、乙醇酸和PR在phr2和ZH11之间没有显著差异（图7D-7K）。
图7 ACP2与磷酸反应基因PHR2的协同作用
ACP2 通过丝氨酸效应间接调节光呼吸途径
作者推测PHR2会与位于ACP2启动子上距起始密码子284bp片段处的motif-GNATATNC结合。因此，作者通过EMSA进一步研究了PHR2和ACP2之间的结合亲和力（图8A）。LUC实验表明PHR2转录可诱导ACP2的表达（图8B）。作者构建了一个PHR2-OE的水稻品系，在Pi-条件下，PHR2-OE2中的ACP2基因表达比ZH11增加了3.5倍（图8C）。作者又通过ChIP-PCR实验，证实了PHR2可刺激ACP2基因的表达（图8D）。
丝氨酸是光呼吸途径中的重要代谢物。为了确定丝氨酸对PR和PPUE的影响，作者进行了丝氨酸喷雾实验。与对照相比，经丝氨酸处理的ACP2突变体在Pi-条件下的Asat Pi-和PPUE值均提高了约10%。PPUE的变化导致用2mM丝氨酸处理的ACP2突变体的地上部生物量比对照组增加了4%。因此，作者得出结论，ACP2的表达与水稻中的PPUE相关。ACP2还可以促进丝氨酸的积累，间接调节光呼吸（图8E）。
图8 PHR2 可转录激活 ACP2 的表达
研究结论
在本研究中，作者研究了由206个水稻品种组成的水稻群体在Pi充足(Pi+)和Pi饥饿(Pi-)处理下PPUE和净光合速率(Asat)的自然变化。基于GWAS，确定了PPUE和AsatPi之间重叠的主效SNP，并通过遗传、分子和生化技术验证了候选基因ACP2的功能。这项研究为ACP2在缺磷期间通过改变丝氨酸代谢和细胞Pi循环来调节PPUE和Asat的遗传机制提供了重要的见解。这些发现可以指导分子选择性育种策略，以提高作物的磷酸盐利用效率并提高粮食产量。